For meget skabelon i pcr

Mængden af ​​totalt DNA i en PCR har en markant effekt på resultatet af en PCR -procedure. Brug af for meget totalt DNA resulterer i pakket DNA i reaktionsbeholderens lukkede rum og kan føre til falsk priming og endda dårlig DNA -syntese på grund af den blokerede diffusion af store Taq -polymerasemolekyler.

1. Hvor meget skabelon skal jeg tilføje til PCR?
2. Kan for meget primer hæmme PCR?
3. Hvad kan få en PCR -reaktion til at mislykkes?
4. Hvor meget DNA er nok til PCR?

Hvor meget skabelon skal jeg tilføje til PCR?

Selvom det i teorien er et molekyle i skabelonen, der ville være tilstrækkeligt, bruges typisk større mængder DNA typisk til en klassisk PCR, for eksempel op til 1 µg genomisk pattedyr -DNA og så lidt som 1 pg plasmid -DNA (1).

Kan for meget primer hæmme PCR?

Forurenende stoffer i dNTP -blandingen kan føre til ufuldstændig eller forkert amplifikation eller PCR -inhibering. Brug dNTP'er i høj kvalitet. Brug af en overdreven koncentration af primere kan øge chancen for, at primere bindes uspecifikt til uønskede steder på skabelonen eller til hinanden.

Hvad kan få en PCR -reaktion til at mislykkes?

At glemme kun en komponent i PCR -reaktionen, uanset om det er DNA -polymerase, primere eller endda skabelon -DNA, vil resultere i en mislykket reaktion. Den enkleste løsning er at gentage reaktionen. ... Hvis der stadig ikke er noget PCR -produkt efter dette, er chancerne stor, at der er noget andet, der forhindrer din reaktion.

Hvor meget DNA er nok til PCR?

I en typisk 50 µL reaktion er 1-2 enheder af DNA -polymerase tilstrækkelige til amplifikation af mål -DNA. Det kan dog være nødvendigt at justere enzymmængderne med vanskelige skabeloner. For eksempel, når inhibitorer er til stede i DNA -prøven, kan forøgelse af mængden af ​​DNA -polymerase forbedre PCR -udbytter.