Topmusicanswers
Fejlfinding af PCR- og RT-PCR-forstærkning
| Problem | Mulig årsag |
|---|---|
| Ingen bånd på gel | Forlængelsestiden var for kort |
| Termisk cykler havde ikke den korrekte temperatur | |
| Ekstra, uspecifikke bånd på gel | Primere hybridiserede til et sekundært sted på skabelonen |
| DNA -kontaminering blev indført i primere eller buffere |
- Hvad forårsager PCR -fejl?
- Hvordan løser du et PCR -problem?
- Hvad ville du gøre, hvis PCR -amplifikationen af en prøve mislykkedes?
- Hvad sker der, når du tilføjer for meget primer til PCR?
Hvad forårsager PCR -fejl?
Normalt er det første forskere gør, at bebrejde et defekt enzym eller reagens, når et eksperiment mislykkes, men med PCR er det faktisk mindre sandsynligt, at det er årsagen til fejl. Oftere er dybere interne problemer som primer -design, termocyklerparametre eller uspecifik binding til andre skabelonsekvenser årsagen.
Hvordan løser du et PCR -problem?
Kontroller amplifikationslængdeevnen for de udvalgte DNA -polymeraser. Brug DNA -polymeraser specielt designet til lang PCR. Vælg DNA -polymeraser med høj processivitet, som kan forstærke lange mål på kortere tid. Reducer udglødnings- og forlængelsestemperaturerne for at hjælpe primerbinding og enzymtermostabilitet.
Hvad ville du gøre, hvis PCR -amplifikationen af en prøve mislykkedes?
Hvis en amplifikationsreaktion mislykkes, og du har mistanke om, at DNA -skabelonen er forurenet med en hæmmer, skal du tilføje det mistænkte DNA -præparat til en kontrolreaktion med en DNA -skabelon og et primerpar, der tidligere har forstærket sig godt .
Hvad sker der, når du tilføjer for meget primer til PCR?
Anvendelse af højere koncentrationer af primere kan have følgende virkninger: Hvis primerne er i stand til at danne dimerer, resulterer deres koncentration kun i dannelsen af primer-dimerer og forbedrer ikke amplifikationen af det ønskede PCR-produkt.
